Pintor de retratos, retablos y composiciones religiosas. Según Karel van Mander, Mostaert nació en Haarlem, en el seno de una familia de nobles, aunque en realidad perteneció a una próspera familia de molineros. Recibió su formación del pintor Jacob van Haarlem, quien probablemente sea el Maestro del Díptico de Brunswick. Mostaert aparece mencionado por primera vez como pintor en 1498, en un documento por el que adquiere una casa en su ciudad natal. En 1500 se le encargó la decoración del relicario de San Bavón de la Groote Kerck de Haarlem, que no ha llegado hasta nuestros días; a partir de esta fecha aparece frecuentemente en los archivos del gremio de pintores del que fue decano en 1507, 1543 y 1544. El número de referencias que le sitúan en Haarlem y los trabajos que allí realizó para la iglesia de San Bavón, indican que desarrolló toda su carrera profesional en la ciudad. Sus primeras pinturas muestran influencias del estilo de Geertgen tot Sint Jans y sus seguidores. En 1519 se convirtió en pintor de corte de Margarita de Austria, gobernadora de los Países Bajos, permaneciendo, según Van Mander, al servició de la infanta durante los dieciocho años siguientes, dato que parece, sin embargo, exagerado.

Sus obras más representativas son los retratos de tres cuartos donde los modelos, situados ante un paisaje, descansan sus manos sobre un cojín colocado en primer plano. Especialmente elegantes son los dípticos con parejas, como el de Hendrik van Merode y su esposa Franziska van Brederode, de la Sint Dimpnakerk, en Geel. A partir de la década de 1520 Mostaert emuló los paisajes panorámicos de artistas de Amberes como Patinir. La última referencia biográfica que de él se conserva es de 1549, cuando solicitó al Ayuntamiento de Haarlem un permiso de residencia temporal en Hoorn, donde estaba ejecutando la decoración del altar de la Groote Kerck.