Considerado una de las grandes personalidades del Renacimiento italiano, se formó, según un documento fechado en 1524, en el taller napolitano de Niccolò Colantonio entre 1443 y 1450. Su conocimiento del arte flamenco, en especial de las obras de Van Eyck y de Van der Weyden, fue fundamental en la formación de su estilo. Se sospecha que Antonello pudo estudiar pinturas de estos artistas en la colección de Alfonso de Aragón.

Entre sus primeras obras se encuentran La Crucifixión, del Muzeul National de Artâ al României en Bucarest, en la que se rastrean las huellas estilísticas de Colantonio, y San Jerónimo en su estudio, de la National Gallery de Londres. En 1457 está documentado en su taller de Mesina, en el que trabajaban su hijo Jacobello y dos sobrinos, aunque de la producción de esa época no se conoce ningún trabajo firmado. En 1465, coincidiendo ya con lo que sería su etapa de madurez, se registra su primer óleo fechado y datado, el Salvator Mundi, de 1465, de la National Gallery de Londres. A esta tabla le siguen el Políptico de san Gregorio, de 1473, hoy en el Museo Regionale de Mesina, y La Anunciación, de 1474, del Museo Nazionale de Siracusa, pintura donde se detectan influencias no sólo de pintores flamencos sino también —como es característico de su última etapa— de Piero della Francesca, Francesco Laurana y Giovanni Bellini. Entre 1475 y 1476 está documentado en Venecia, donde ejecutó el Retablo de san Casiano, hoy fragmentado, cuya parte central, una Virgen con el Niño, se halla en el Kunsthistorisches Museum de Viena. Vinculadas a esta etapa veneciana están dos de sus obras maestras: San Sebastián, de la Gemäldegalerie de Dresde, y Cristo muerto sostenido por un ángel, del Museo del Prado. Su paso por Venecia se ha considerado histórico por la profunda impresión que dejó en un género como el retrato. De su faceta como retratista hay que resaltar el conocido Condottiere, de 1475, en el Musée du Louvre, o la cabeza conservada en Turín. Antonello fue un innovador, especialmente en el campo técnico, y está considerado el introductor de la pintura al óleo en Italia. Murió en febrero de 1479, según Vasari a la edad de cuarenta y nueve años.

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